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細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的成功要從用水的選擇開始!
點(diǎn)擊次數(shù):2371 更新時(shí)間:2019-07-16

細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中水的質(zhì)量要求

提起細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),每個(gè)經(jīng)歷過的實(shí)驗(yàn)者都會(huì)有這樣的領(lǐng)悟吧,

細(xì)胞虐我千百遍,我待細(xì)胞如初戀。

明明小心翼翼的操作,

細(xì)胞總會(huì)莫名其妙的被污染了!

莫名其妙的掛掉啦!

到底怎么回事呢?

其實(shí)造成細(xì)胞污染的因素不單單是微生物,培養(yǎng)環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。水是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中,才能為細(xì)胞吸收和排泄。對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞來說,水是所有細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑中簡(jiǎn)單、但也是重要的組分。所以,細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高,培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì),即使含量極微,有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng),甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

水中的雜質(zhì)對(duì)水質(zhì)有不同影響:

1.離子——平衡滲透壓;一些重金屬 (Cadmium)對(duì)細(xì)胞毒害大,即便劑量很低 (< 0.1 ppb); 

2.微生物——污染,改變微環(huán)境如pH,影響增殖,死后釋放內(nèi)毒素等;

3.內(nèi)毒素——改變細(xì)胞外形、活化細(xì)胞、促進(jìn)或抑制細(xì)胞分裂、影響細(xì)胞附著等;

4.有機(jī)物——影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

水質(zhì)評(píng)價(jià)常用的指標(biāo):

1. 電阻率(electrical resistivity)

衡量實(shí)驗(yàn)室用水導(dǎo)電性能的指標(biāo),單位為MΩ•cm,隨著水內(nèi)無機(jī)離子的減少電阻數(shù)值逐漸變大。

2. 異體菌落數(shù)(Heterotrophic bacteria count,HBC)

衡量實(shí)驗(yàn)室用水微生物的指標(biāo),單位為cfu/mL。

3. 有機(jī)物(Total Organic Carbon ,TOC)

水中碳的濃度,反映水中可氧化的有機(jī)化合物的含量,可間接反映出水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。

4. 內(nèi)毒素(Endotoxin)

革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖細(xì)胞壁碎片,又稱之為“熱原”,單位EU/mL。

 

參考標(biāo)準(zhǔn)化組織的實(shí)驗(yàn)室純水規(guī)范ISO3696,美國(guó)CLSI和ASTM D1193的試劑純水規(guī)范,我國(guó)GBT6682和GBT 30301的試驗(yàn)用水指導(dǎo),《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源的描述標(biāo)準(zhǔn)與管理規(guī)范》用水指導(dǎo),結(jié)合多年的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出細(xì)胞培養(yǎng)用水對(duì)水質(zhì)的要求。

 

細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水質(zhì)的要求:

1.一定要無菌:HBC < 0.01 cfu/mL

2.無蛋白及核酸酶和內(nèi)毒素:無內(nèi)毒素或無熱源<0.03EU/mL

3.阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)的有機(jī)物含量要低:TOC <5 ppb

4.去除離子含量:電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)

 

細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中純水機(jī)的配置要求

 

細(xì)胞培養(yǎng)過程中,各種培養(yǎng)液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過嚴(yán)格的純化處理,不含離子和其他的雜質(zhì),即使是儲(chǔ)存試劑的玻璃器皿,在自來水沖洗過后也應(yīng)用超純水漂洗三次以上。目前,市場(chǎng)上供應(yīng)的純水裝置種類較多,比如自來水進(jìn)水同時(shí)制備二級(jí)純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置,可以由自來水進(jìn)水通過預(yù)處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI(連續(xù)電流電去離子)模塊等純化后達(dá)到二級(jí)純水,儲(chǔ)存于水箱中以滿足日常的清洗應(yīng)用;水箱中的水再經(jīng)過U Pack超純化柱去離子,紫外燈照射殺菌并降低有機(jī)物含量,后經(jīng)終端濾器RephiBio過濾,以獲得無菌、無熱源、無核酸酶的超純水。

 

水路圖

 

要想達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)用水的水質(zhì)要求,純水機(jī)的配置非常關(guān)鍵,帶有消毒模塊的純水水箱、終端過濾器、取水水質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等配置都關(guān)系著產(chǎn)水水質(zhì)是否達(dá)標(biāo)。

純水的儲(chǔ)存對(duì)保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的,由于周圍環(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH,所以儲(chǔ)存水的容器要盡量密封,避免和外界過多接觸,抑制微生物生長(zhǎng)。如Genie純水設(shè)備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器,能夠大限度的保證水箱內(nèi)的純水水質(zhì)。

 

水箱空氣過濾器(含CO2吸附劑)200/350L 水箱空氣過濾器

主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài)

 

終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物,滿足不同實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用需求。對(duì)于細(xì)胞體外培養(yǎng)可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器,安裝在樂楓超純水系統(tǒng)的出水口,可有效去除水中的熱原(內(nèi)毒素)、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì),制備符合細(xì)胞培養(yǎng)用水要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌)。

 

 

對(duì)于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率、細(xì)菌和內(nèi)毒素的含量必須做到即取即用,因此取水的遠(yuǎn)程監(jiān)控和水質(zhì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)(如上面提到的Genie),將水機(jī)和取水手柄分別放在潔凈間的內(nèi)外,通過無線控制取水手柄達(dá)到超純水的取用和實(shí)時(shí)檢測(cè)水的電阻率和TOC數(shù)值,非常適合無菌環(huán)境下的操作,大限度減少污染。

 

無線 · 自由
  • 局域網(wǎng)無線通信技術(shù) 

  • 各單元擺脫信號(hào)線羈絆

  • 主機(jī),主控屏,手柄擺放可自由組合 

 

手柄觸屏信息

 

? 系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài):待機(jī),泄壓,循環(huán),產(chǎn)水

? 水箱液位:0%或者L

? 純水(超純水)水質(zhì)參數(shù):電阻率、TOC、溫度

   

 終 端 水 質(zhì)

                 實(shí) 時(shí) 監(jiān) 測(cè)

 

結(jié)合上述用水要求,為大家推薦兩款制備超純水的水機(jī),Genie G一體化純水儀Genie PURIST 超純水儀。 

 

Genie G一體化純水儀

以自來水為進(jìn)水制備超純水和 EDI 二級(jí)純水

性能指標(biāo)

Genie PURIST 超純水儀

以純水(EDI 純水,RO 水或蒸餾水等)為進(jìn)水,制備實(shí)驗(yàn)室超純水。

性能指標(biāo)

 

【注意事項(xiàng)】

1.超純水應(yīng)當(dāng)注意使用時(shí)間,應(yīng)該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導(dǎo)致水質(zhì)下降。

2.在合適的環(huán)境使用超純水。環(huán)境中的VOC(揮發(fā)性有機(jī)物),細(xì)菌等都會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)細(xì)胞的容器應(yīng)當(dāng)潔凈無污染。 

4.配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí),宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液,緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機(jī),避免鈣、鎂離子促使細(xì)胞凝聚作用的產(chǎn)生。

 

不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇指南

 

細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等),使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)流程中實(shí)驗(yàn)用水貫穿每一個(gè)環(huán)節(jié):

 

1.取材:組織的清洗和灌注試劑用水,如PBS緩沖液、Hanks液的配制;

2.原代培養(yǎng):1640、DMEM等培養(yǎng)基用水,明膠等支持物的配制,添加藥物、檢測(cè)試劑的配制;

3.傳代培養(yǎng):胰酶等消化液的配制;

4.凍存:細(xì)胞凍存液DMSO的配制。

 

細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞類型一般分為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng),其中難的是動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)除了需要無菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件,它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì),其中原代細(xì)胞的培養(yǎng)是難的。植物細(xì)胞的培養(yǎng)需要光照和激素,而且培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)比較成熟。微生物培養(yǎng)多為單細(xì)胞生物,微生物人工培養(yǎng)的條件比動(dòng)植物細(xì)胞簡(jiǎn)單得多,蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養(yǎng)基即可滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)要求,其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復(fù)雜,需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。

 

由于細(xì)胞的種類和培養(yǎng)條件不同,對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同,那么配制培養(yǎng)基或試劑用水的選擇大有講究,不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水的指標(biāo)如下:

 

細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇

細(xì)胞類型

純水等級(jí)

電阻率

(MΩ·cm)

TOC

(ppb)

微生物

(cfu/mL)

內(nèi)毒素(Eu/mL

核酸酶

(pg/mL)

動(dòng)物細(xì)胞

超純水

>18

<10

<1

<0.002 

ND

植物細(xì)胞

超純水

>18

<10

<1

<0.002 

ND

微生物

實(shí)驗(yàn)室Ⅱ級(jí)純水

>10

<50

<1

NA

NA

從上表可以看出,動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)去除內(nèi)毒素和核酸酶的要求很高,用于這兩類細(xì)胞培養(yǎng)可以選擇商品化的細(xì)胞培養(yǎng)用水,另外去除純水中的內(nèi)毒素和核酸酶可以通過在純水機(jī)的取水口安裝終端濾器達(dá)到。

 

各種細(xì)胞培養(yǎng)用水的比較

細(xì)胞培養(yǎng)用水

制備方法

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

商品化細(xì)胞培養(yǎng)用水

純水或超純水進(jìn)行多效蒸餾制成,嚴(yán)格控制熱源、無菌、內(nèi)毒素、pH、滲透壓等指標(biāo)

水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程度化高,可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性

價(jià)格昂貴

DEPC

DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水,無RNase、DNAaseproteinase

*去除核酸酶

價(jià)格昂貴,未去除內(nèi)毒素

終端濾器過濾超純水

采用0.22µm的過濾膜,可有效去除水中的熱原(內(nèi)毒素)、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì)。

性價(jià)比高,供水量大

對(duì)取水環(huán)境要求高

樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜,可制備符合生物領(lǐng)域應(yīng)用要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌),純水中內(nèi)毒素含量低于0.001 Eu/mL,核酸酶的含量低于可檢測(cè)范圍,微生物的含量低于0.1 cfu/mL,可以滿足動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的需求。

Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個(gè)月,以保證使用效果。

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